王建设/邢清和教授团队对USP53缺陷低GGT胆汁淤积致病机制的研究取得新进展

泛素特异性蛋白酶53（USP53）缺陷病由USP53基因的功能缺失性变异导致。2020年我院王建设教授领衔的肝病团队在国际上率先报道USP53缺陷引起的低GGT胆汁淤积症谱，并详细阐述了其病理特征及超微结构改变。该病造成患儿肝内胆汁淤积，部分严重患者需要肝移植才能长期存活。因为该疾病的致病机制不清楚，缺乏针对性的治疗方法。

为探究USP53缺陷导致低GGT胆汁淤积症机制这一科学问题，并寻找新的治疗方法，王建设/邢清和教授团队结合细胞模型和Usp53基因肝脏特异性敲除小鼠模型，深入探索潜在的致病机制，取得了突破性进展。相关研究成果最近发表于国际著名学术期刊《Hepatology》。

我院王建设教授团队长期致力于儿童肝病的诊断和治疗。2017年，王建设教授/邢清和教授团队国际上首次鉴定MYO5B双等位基因突变是家族性肝内胆汁淤积（progressive familial intrahepatic cholestasis，PFIC）10型致病基因之后，王建设教授团队于2020年又报道了USP53是部分不明原因低GGT胆汁淤积症的致病基因。该病的肝脏病理特征为典型的多核巨细胞样变伴肝细胞内胆汁淤积，患者肝脏免疫组化染色发现胆盐外运泵（bile salt export pump, BSEP）出现异常细胞质定位，这与MYO5B变异导致的PFIC-10患者特征相似。有研究指出， USP53与紧密连接蛋白TJP2在内耳细胞中共定位，提示USP53可能作为紧密连接组分，参与血胆屏障（bile-blood barrier, BBB）的构建。然而，团队此前构建的Usp53肝脏特异性敲除小鼠模型并未发现明显的BBB受损，并且该理论无法解释患者低GGT的表型，潜在的致病机制亟待揭示。

论文的主要研究发现：

USP53缺陷患者肝组织免疫组化染色提示BSEP定位异常，出现细胞质/毛细胆管膜下堆积现象，研究者使用RNAi技术和免疫荧光染色分别在HepG2和HeLa细胞系中复现了该现象，使用生物素细胞膜提取技术进一步证明敲低USP53足以引起膜BSEP数量减少。这些结果说明USP53调节BSEP在毛细胆管处的定位。

研究者通过CRISP-Cas9技术构建USP53敲除的HepG2细胞株（HepG2USP53-KO），并通过透射电镜观察到了大量的膜下囊泡聚集。为了探究患者肝脏和细胞模型中观察到的BSEP胞内聚集体位于何种细胞器中，研究者使用免疫荧光共同标记BSEP和相关细胞器，发现敲除珠中出现的细胞质内BSEP聚团定位于Rab11a阳性顶端循环内体（apical recycling endosome, ARE）中。

这一现象与先前报道的MYO5B错义突变导致的毛细胆管蛋白细胞质异常定位非常相似，MYO5B是一种肌动蛋白依赖的马达蛋白，已被证明参与肝细胞内BSEP的转运。此外，研究团队通过RNA-seq发现USP53缺陷患者肝脏MYO5B表达量显著增加。以上证据提示USP53很可能参与MYO5B介导的BSEP胞内转运过程。为证明这一假说，研究者通过免疫共沉淀（co-IP）和免疫荧光实验证明USP53与MYO5B存在互作并共定位于毛细胆管膜，但敲除USP53并不影响MYO5B与BSEP的共定位。

研究团队推测，USP53的缺失不影响MYO5B与BSEP所在囊泡的结合，但破坏MYO5B的运动功能，导致BSEP不能正确被运输到毛细胆管膜发挥功能。为了证明这一假说，研究者进行活细胞荧光共聚焦拍摄以观察BSEP的胞内转运动态过程。在野生型HepG2细胞中，MYO5B与BSEP共定位于细胞质附近的囊泡中（少量BSEP定位于膜上），240分钟后MYO5B-BSEP囊泡迁移至膜下区域，形成清晰的膜下“BSEP池”，且BSEP膜定位显著增加；而在HepG2USP53-KO中，BSEP和MYO5B仅存在于微弱且分散的胞质囊泡中，这些囊泡无法迁移至细胞膜下区域形成“BSEP池”，240分钟后，未观察到细胞膜处的BSEP信号，这些囊泡转而聚集于细胞核旁区域。这一结果直观地证明，MYO5B介导的BSEP胞内转运过程需要USP53的存在，USP53缺失破坏BSEP的毛细胆管定位。

为了深入研究USP53对MYO5B的调控机制，研究者构建了MYO5B截短蛋白，并证明USP53结合于MYO5B的IQ结构域。令人激动的是，MYO5B相关胆汁淤积症PFIC-10的高频变异位点MYO5B-p.(Arg824Cys)正位于IQ结构域。研究者通过co-IP实验证明Arg824Cys变异破坏MYO5B与USP53的结合，并且在野生型细胞中过表Arg824Cys变体复刻了HepG2USP53-KO中的疾病表型。这一发现进一步证明与USP53的结合对于MYO5B的运输功能至关重要。

USP53属于泛素特异性蛋白酶家族成员，然而此前关于其是否具有去泛素化酶活性存在争议。2024年一篇研究指出USP53存在K63位去泛素化酶活性，与调控蛋白质降解的K48泛素链不同，K63泛素链在调控蛋白质相互作用中起重要作用，并被认为参与囊泡运输过程。这一报道引起了研究团队的关注，通过co-IP实验，研究者发现HepG2USP53-KO中MYO5B泛素化水平显著升高；荧光漂白后恢复实验（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP）证明USP53缺失造成MYO5B对循环内体的招募能力下降。这些结果说明MYO5B是USP53的去泛素化酶底物之一，肝细胞中缺失USP53会增加MYO5B的泛素化水平，并改变内体募集动力学。

本研究的重要意义：

本研究揭示了USP53全新的致病机制：USP53对于马达蛋白MYO5B具有去泛素化作用，USP53的缺失破坏了携带BSEP的RAB11A阳性囊泡从细胞核附近的区域向毛细胆管的运输，导致BSEP胞内运输出现障碍，产生低GGT胆汁淤积。这与学界对该疾病致病机制的以往观点不同，后者认为USP53缺陷破坏BBB导致胆汁淤积，然而这一观点与动物模型结果相反，且不能解释患者低GGT的表型。

王建设教授团队最新动物模型证实MYO5B-p.（Arg824Cys）小鼠肝脏Bsep出现异常定位。本研究首次证明MYO5B相关胆汁淤积症PFIC-10中的高频变异体——位于IQ结构域的MYO5B-p.（Arg824Cys）会完全破坏MYO5B与USP53的相互作用，这为两种PFIC疾病找到了共同的致病机制。本研究通过在分子层面建立不同类型PFIC与不同基因及基因变异之间的关联，有望为开发新型治疗方案和鉴定新型PFIC致病基因提供指引。

该研究共历时四年，JJB竞技宝平台登录入口博士生丁健为第一作者，竞技宝app官方及生物医学研究院双聘教授邢清和、竞技宝app官方王建设教授、“复旦学者”项目专家，格罗宁根大学的Sven C. D. van IJzendoorn教授为共同通讯作者。王建设课题组的博士生佘慧宇、博士后成业等对本文亦有重要贡献。

相关文献：

1.Ding J, She H, Cheng Y, Sun H, Feng J, Liu T, Qiu Y, et al. A novel mechanism involving USP53-regulated BSEP trafficking underlies low-GGT intrahepatic cholestasis. Hepatology 2025.

2.Zhang J, Yang Y, Gong J, Li L, Li J, Zhang M, Lu Y, et al. Low-GGT intrahepatic cholestasis associated with biallelic USP53 variants: Clinical, histological and ultrastructural characterization. Liver Int 2020;40:1142-1150.

3.Ding J, Chi H, Qiu Y, Wang R, Yang J, She H, Zhang J, et al. Loss of hepatocyte Usp53 protects mice from a form of xenobiotic-induced liver injury. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis 2024;1871:167624.

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